摘要：Y染色體無(wú)精子癥因子（AZF）缺失檢測(cè)是診斷無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥的關(guān)鍵技術(shù)。作為2013年EAA/EMQN指南的修訂版，新版指南在回顧總結(jié)以往臨床相關(guān)進(jìn)展的基礎(chǔ)上，對(duì)舊版指南內(nèi)容進(jìn)行了大量更新，并對(duì)EAA/EMQN提供的外部質(zhì)量評(píng)估項(xiàng)目結(jié)果做出了反饋。基礎(chǔ)多重PCR檢測(cè)體系結(jié)合擴(kuò)展性缺失分析，仍然是目前檢測(cè)和正確解釋AZF缺失的金標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，對(duì)sY84引物序列進(jìn)行了更新，且對(duì)AZFa和AZFb缺失斷點(diǎn)的可互換邊界位點(diǎn)也進(jìn)行了改進(jìn)。具體而言，新版指南不再推薦sY83和sY143被用于擴(kuò)展性缺失分析，而是將sY1064和sY1192作為首選位點(diǎn)。盡管目前有些國(guó)家AZF缺失檢測(cè)正在向注冊(cè)試劑盒化過(guò)渡，但應(yīng)注意的是，許多商業(yè)產(chǎn)品由于包含大量不必要位點(diǎn)而不被推薦使用。此外，目前這些可用產(chǎn)品都不符合用于擴(kuò)展性缺失分析的新首選位點(diǎn)。AZFc區(qū)域gr/gr部分缺失是精子發(fā)生障礙人群特異性危險(xiǎn)因素，也是睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的易感因素。但這種缺失類(lèi)型的檢測(cè)與否仍需由診斷實(shí)驗(yàn)室和送檢臨床醫(yī)生自行決定。鑒于EMQN/EAA計(jì)劃運(yùn)行22年的經(jīng)驗(yàn)表明，參與計(jì)劃的實(shí)驗(yàn)室基因型診斷錯(cuò)誤率大幅下降，診斷報(bào)告質(zhì)量也極大改善，強(qiáng)烈鼓勵(lì)A(yù)ZF檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室每年參與該外部質(zhì)量控制計(jì)劃。

 

Y染色體無(wú)精子癥因子（azoospermia factor，AZF）缺失是導(dǎo)致男性不育的第二大遺傳因素，其發(fā)生率僅次于克氏綜合征。在普通人群中，約每4000名男性中就有1人存在Y染色體微缺失，而在不育男性中其發(fā)生率更高。不同實(shí)驗(yàn)室AZF微缺失發(fā)生率為2%~10%（甚至更高），主要由研究人群組成差異導(dǎo)致。通常，接受外部機(jī)構(gòu)送檢的常規(guī)診斷實(shí)驗(yàn)室在沒(méi)有控制患者選擇的情況下的發(fā)病率要低得多，通常低于2%。
已發(fā)表數(shù)據(jù)和質(zhì)量控制計(jì)劃都證實(shí)，不同實(shí)驗(yàn)室采取的檢測(cè)方案差異，確實(shí)會(huì)導(dǎo)致不準(zhǔn)確或完全錯(cuò)誤的診斷，表明檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制的必要性。也因此，歐洲男科學(xué)會(huì)（EAA）和分子遺傳質(zhì)量協(xié)作網(wǎng)（EMQN CIC）聯(lián)合開(kāi)始提供外部質(zhì)量評(píng)估（EQA）計(jì)劃，并定期發(fā)布Y染色體微缺失分子診斷的實(shí)驗(yàn)室指南。

經(jīng)10年數(shù)據(jù)積累，本次EAA/EMQN關(guān)于Y染色體AZF微缺失分子診斷指南作出了大量更新，以更好服務(wù)于臨床。更新要點(diǎn)：
01 AZFa近端邊界位點(diǎn)sY83和sY1064不可互換，因?yàn)樗鼈兊慕Y(jié)果取決于檢測(cè)到的AZFa完全缺失近端斷點(diǎn)的變化。重要的是，AZFa完全缺失可以與sY83（present）和sY1064（absent）兼容。因此，在強(qiáng)制擴(kuò)展性缺失分析中只推薦sY1064，而不推薦sY83。
02 AZFb遠(yuǎn)端邊界位點(diǎn)sY143和sY1192不能互換，只有sY1192能夠區(qū)分AZFb完全和部分缺失（從而為T(mén)ESE成功與否提供可靠預(yù)后）。因此，在強(qiáng)制擴(kuò)展性缺失分析中只推薦sY1192，而不推薦sY143。
03 對(duì)sY84的正向引物和反向引物序列進(jìn)行了更新，以避免正向引物錯(cuò)配，同時(shí)反向引物兼容亞洲人群的SNP。
04 AZFb缺失斷點(diǎn)的可變性可導(dǎo)致大量AZFb和AZFbc完全缺失中sY1224近端邊界位點(diǎn)的保留。盡管這種變異的表型尚不清楚，但建議優(yōu)先使用sY121，再使用sY1224（如果sY121缺失）。
05 據(jù)目前所知，擴(kuò)展性缺失分析中首選位點(diǎn)的變化與目前市面上任何AZF缺失分子診斷試劑盒都不完全兼容。

 

一、Y染色體微缺失遺傳學(xué)檢測(cè)的適應(yīng)癥

AZF缺失檢測(cè)的精液評(píng)估閾值尚未達(dá)成共識(shí)。精子濃度<2×106/mL的無(wú)精癥或嚴(yán)重少精癥患者一般能夠發(fā)現(xiàn)臨床相關(guān)的缺失，而精子濃度在2~5×106/mL之間的不育患者很少有此發(fā)現(xiàn)。2010版《WHO人類(lèi)精液檢查和處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》將生精指標(biāo)改為精子總數(shù)，歐洲臨床指南現(xiàn)今仍然將AZF缺失檢測(cè)的精子總數(shù)閾值設(shè)定為＜500萬(wàn)精子/mL；然而，在精子濃度>1×106/mL的男性中，該檢測(cè)的成本效益受到質(zhì)疑。但無(wú)論如何，一致建議對(duì)無(wú)精子癥男性進(jìn)行Y染色體缺失篩查，因?yàn)樗粌H可以提供病因診斷，而且可以對(duì)TESE的成功率進(jìn)行可靠估計(jì)。

圖1為本指南建議的分析步驟流程圖，分為基礎(chǔ)檢測(cè)體系和擴(kuò)展性檢測(cè)體系。常規(guī)臨床參數(shù)，如激素水平、睪丸體積、精索靜脈曲張、睪丸發(fā)育不良、感染等，沒(méi)有任何預(yù)測(cè)價(jià)值。通常，染色體異常（46,XY/45,X核型除外）、梗阻性無(wú)精子癥（除非FSH高于正常限值）或促性腺功能減退癥患者不需要進(jìn)行Y染色體分子分析。然而，在非特發(fā)性不育男性中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多缺失攜帶者，即患有睪丸腫瘤、附睪閉塞、睪丸炎、精索靜脈曲張或化療/放療后的患者。因此，任何伴有無(wú)精子癥或嚴(yán)重少精癥的診斷都應(yīng)該是AZF檢測(cè)的指征。例如，對(duì)屬于上述精液類(lèi)別的男性，在精索靜脈曲張切除術(shù)前進(jìn)行AZF篩查很重要，因?yàn)槿笔y帶者很可能不會(huì)從手術(shù)中受益。Klinefelter患者檢測(cè)Y染色體缺失的臨床實(shí)用性尚未確定。

圖1（A）AZF基礎(chǔ)檢測(cè)體系及診斷流程

 

 

圖1（B）AZF擴(kuò)展性缺失檢測(cè)體系及診斷流程

 

 

二、Y染色體男性特異性區(qū)域結(jié)構(gòu)

Y染色體男性特異性區(qū)域（MSY）參考序列包含156個(gè)轉(zhuǎn)錄單位（其中包括78個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，編碼27種不同的蛋白質(zhì)），分為三種類(lèi)型：X-退化區(qū)（X-degenerate；來(lái)自染色體祖先狀態(tài)的單拷貝基因或假基因）、X-換位區(qū)（X-transposed；從X染色體獲得，與相應(yīng)的X區(qū)域99%同源）以及擴(kuò)增區(qū)（ampliconic）。其中，后者對(duì)應(yīng)于重復(fù)區(qū)，分為多個(gè)家族類(lèi)型，每個(gè)重復(fù)區(qū)在家族內(nèi)重復(fù)之間共享幾乎完全（>99.9%）的同一性。擴(kuò)增區(qū)包含9個(gè)睪丸特異性或富集表達(dá)的蛋白質(zhì)編碼基因家族。最初，這些家族估計(jì)至少有60個(gè)編碼基因，現(xiàn)在這個(gè)數(shù)字已經(jīng)增加到超過(guò)100個(gè)。由于擴(kuò)增區(qū)的高度重復(fù)性，既可以進(jìn)行基因轉(zhuǎn)換，也可以進(jìn)行非等位基因（染色體內(nèi)）同源重組（NAHR）。擴(kuò)增子可以沿著MSY以有序的方式排列，從而形成回文：在MSY的相當(dāng)長(zhǎng)范圍內(nèi)延伸的不同擴(kuò)增子重復(fù)的鏡像塊。擴(kuò)增子（和回文）組織增強(qiáng)了結(jié)構(gòu)變異的產(chǎn)生，如缺失、重復(fù)和倒位。普遍認(rèn)為，NAHR是產(chǎn)生AZF完全缺失的主要驅(qū)動(dòng)力。這些交換發(fā)生在具有相同反向高度同源重復(fù)序列之間，導(dǎo)致它們之間遺傳物質(zhì)的丟失（以及姐妹染色單體中的相互重復(fù)）。考慮到MSY的高度重復(fù)性體系結(jié)構(gòu)，已經(jīng)確定了許多不同的MSY重排。只有明確確定與男性不育相關(guān)的才是本指南的重點(diǎn)。

 

三、Y染色體缺失類(lèi)型及其分子機(jī)制

圖2 Y染色體示意圖和臨床相關(guān)微缺失模式

 

本指南依舊沿用經(jīng)典Y染色體微缺失區(qū)域的定義模式，分為：AZFa區(qū)缺失、AZFb區(qū)缺失、AZFbc區(qū)缺失和AZFc區(qū)缺失。

 AZFa區(qū)域：長(zhǎng)792kb，包含單拷貝基因USP9Y（原DFFRY）和DDX3Y（原DBY）。第三個(gè)基因，UTY，功能未知，定位于該區(qū)遠(yuǎn)端。AZFa完全缺失的起源可追溯到HERVyq1和HERVyq2逆轉(zhuǎn)錄病毒序列中同向的相同序列塊之間的NAHR。重組可發(fā)生在這些逆轉(zhuǎn)錄病毒序列（ID1和ID2）中兩個(gè)相同序列塊中的一個(gè)，導(dǎo)致至少兩種略有不同的缺失模式。無(wú)論如何，AZFa完全缺失都丟失了約792kb，包含USP9Y和DDX3Y缺失。

 AZFb和AZFc這兩個(gè)區(qū)域共包含24個(gè)不同的基因，其中大多數(shù)存在于多個(gè)拷貝中。AZFb完全缺失刪除了6.2Mb（包括32個(gè)轉(zhuǎn)錄單位），并且是由P5/近端P1回文之間的NAHR引起。因此，AZFb完全缺失也可以稱(chēng)為P5/近端P1缺失。AZFc區(qū)包括12個(gè)基因，每個(gè)基因以可變拷貝數(shù)存在，總共32個(gè)轉(zhuǎn)錄單元。AZFc完全缺失去除3.5Mb（共21個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，其中10個(gè)被認(rèn)為是蛋白質(zhì)編碼），并分別源自回文P3和P1中b2和b4擴(kuò)增子之間的NAHR。類(lèi)似于AZFb缺失，AZFc完全缺失也可以基于NAHR事件的干預(yù)靶點(diǎn)（即b2/b4缺失）來(lái)參考。

 AZFb和AZFc區(qū)域的異常重復(fù)增加了額外重排的發(fā)生，這些重排也可能與它們對(duì)精子發(fā)生的影響有關(guān)。一些對(duì)應(yīng)于幾乎全部去除AZFb和AZFc區(qū)域的缺失模式。這些AZFbc缺失是通過(guò)兩種主要機(jī)制發(fā)生的，涉及P5/遠(yuǎn)端P1之間（7.7Mb，丟失42個(gè)轉(zhuǎn)錄單位）或P4/遠(yuǎn)端P1之間（7.0Mb，失去38個(gè)轉(zhuǎn)錄單位）的NAHR。此外，AZFc區(qū)域內(nèi)較少的缺失（部分缺失）也會(huì)限制精子發(fā)生，這些是本指南重點(diǎn)。

綜上所述，以下復(fù)發(fā)性Y染色體完全微缺失具有臨床相關(guān)性，是無(wú)精子癥或嚴(yán)重少精癥男性生精障礙的原因（圖2）：
—AZFa
—AZFb（P5/近端P1）
—AZFc（b2/b4）
—AZFbc（P5/遠(yuǎn)端P1或P4/遠(yuǎn)端P1）

最常見(jiàn)的完全缺失類(lèi)型是AZFc缺失（70%-80%），其次是AZFa缺失（0.5%-9%）、AZFb缺失（1%-7%）和AZFbc缺失（1%-20%）。AZFabc缺失最有可能與異常核型有關(guān)，如46,XX男性或iso(Y)。

 

 

四、AZF完全缺失的基因型-表型相關(guān)性

AZF缺失與生精失敗特異性相關(guān)。盡管已經(jīng)報(bào)道了一些罕見(jiàn)的AZFc完全缺失自然傳播病例，但它們主要反映了這樣一個(gè)事實(shí)，即在特殊條件下，精子數(shù)量非常低的男性可以進(jìn)行自然受精。因此，將Y缺失視為無(wú)精子/少精子癥的原因而不是“不育”的原因更為合適。AZF缺失檢測(cè)具有預(yù)后價(jià)值，并可能影響治療選擇。應(yīng)為所有符合TESE結(jié)合卵胞漿內(nèi)單精子注射（TESE-ICSI）條件的無(wú)精子癥患者提供缺失篩查。

 AZFa區(qū)域完全缺失導(dǎo)致唯支持細(xì)胞綜合征（SCO）睪丸表型和無(wú)精子癥。AZFa區(qū)域完全缺失表明TESE-ICSI幾乎不可能取到睪丸精子。

 AZFb和AZFbc區(qū)域（P5/近端P1、P5/遠(yuǎn)端P1、P4/遠(yuǎn)端P1）完全缺失與無(wú)精子癥有關(guān)，大約一半的男性具有SCO睪丸表型，另一半表現(xiàn)為生精性阻滯（通常具有正常的FSH和正常的睪丸體積），從而阻止男性配子的成功產(chǎn)生。與AZFa完全缺失類(lèi)似，AZFb完全缺失的男性也幾乎不可能通過(guò)TESE獲得精子。然而，罕見(jiàn)的非典型AZFb或AZFbc缺失也可嘗試?yán)肨ESE進(jìn)行取精，這種缺失特征為P4回文的近端斷點(diǎn)（而不是P5）。事實(shí)上，在P4處具有近端斷點(diǎn)的較小缺失可能與額外的AZFb基因拷貝的保留有關(guān)，如XKRY、CDY2和HSFY，因此導(dǎo)致了TESE陽(yáng)性結(jié)果的可能。同樣，通過(guò)保留遠(yuǎn)端sY1192位點(diǎn)（擴(kuò)展性缺失分析的一部分）確定的部分AZFb缺失也可以與殘余精子兼容。強(qiáng)調(diào)區(qū)分完全（P5/近端P1）和部分AZFb缺失的重要性。考慮到以上情況，新版指南建議在強(qiáng)制擴(kuò)展性缺失分析步驟中，確定AZFb缺失的遠(yuǎn)端斷點(diǎn)時(shí)，將sY1192作為首選位點(diǎn)，而不是sY143。需要強(qiáng)調(diào)的是，不僅遠(yuǎn)端斷點(diǎn)，近端斷點(diǎn)也可以區(qū)分TESE陰性和TESE陽(yáng)性患者。因此，執(zhí)行擴(kuò)展性缺失分析是最重要的，因?yàn)樵撔畔⒆罱K確定是否應(yīng)該嘗試TESE。只有完整的檢測(cè)結(jié)果（包括基礎(chǔ)和擴(kuò)展性缺失位點(diǎn)）才能對(duì)AZFb缺失男性的生殖選擇提供必要見(jiàn)解。在sY1192陰性P5/近端P1缺失的情況下，不建議使用TESE，因?yàn)樘崛〉骄拥臋C(jī)會(huì)非常低/幾乎為零。然而，應(yīng)該注意的是，可能由于遺傳背景效應(yīng)，sY1192陰性的AZFb和AZFbc缺失與完全精子發(fā)生相兼容的情況雖極為罕見(jiàn)，但也有發(fā)生。

 AZFc完全缺失（b2/b4）與無(wú)精子癥或嚴(yán)重少精子癥有關(guān)，對(duì)精子發(fā)生有強(qiáng)烈的有害影響。但與AZFa和AZFb相反，AZFc完全缺失也有可能有殘留精子發(fā)生。多項(xiàng)研究表明，與這種缺失類(lèi)型相關(guān)的生精損傷表型會(huì)隨著時(shí)間的推移而加重，但也有研究未能復(fù)現(xiàn)這種影響。AZFc完全缺失患者通過(guò)TESE獲得精子的幾率平均約為50%，但差異很大（從15%到71%），一方面是患者自身生物學(xué)上的差異，另一方面也說(shuō)明了TESE技術(shù)方面的差異。根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)，外周血中45%以上的X細(xì)胞系可被認(rèn)為是精子發(fā)生的負(fù)面預(yù)測(cè)因素。

 

五、遺傳咨詢(xún)

5.1 遺傳咨詢(xún)

遺傳咨詢(xún)是強(qiáng)制性環(huán)節(jié)，以向患者提供有關(guān)妊娠精子發(fā)生受損男性后代風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)信息。

 AZFc缺失以及AZFa和AZFb部分缺失，因?yàn)槠淇蛇z傳性，需要對(duì)其男性家庭成員進(jìn)行遺傳咨詢(xún)。

 AZFa、AZFb和AZFabc的完全缺失通常沒(méi)有精子產(chǎn)生，因此不建議進(jìn)行家族篩查，也不應(yīng)在報(bào)告中提及。

 非終端AZFbc缺失通常與非參考Y染色體相關(guān)，在一些非典型缺失病例中，盡管生精功能?chē)?yán)重受損，但仍可能有精子發(fā)生。這類(lèi)缺失將強(qiáng)制性地傳遞給其男性后代，因此，患者應(yīng)被告知妊娠精子發(fā)生受損男性后代的風(fēng)險(xiǎn)。

 

5.2 生殖策略

 如果精液或睪丸中存在精子，AZF缺失患者可以自然受孕（在一些極罕見(jiàn)的AZFc完全缺失的病例中）或通過(guò)MAR受孕。AZFc完全缺失患者行ICSI的研究已有報(bào)道，個(gè)別研究發(fā)現(xiàn)缺失對(duì)關(guān)鍵MAR參數(shù)有負(fù)面影響，如受精率、胚胎質(zhì)量和活產(chǎn)率下降，但大多數(shù)研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)AZFc完全缺失與未缺失男性在受精率和妊娠率方面存在任何顯著差異。因此，這種缺失是否對(duì)MAR結(jié)果有任何顯著影響仍然是一個(gè)有爭(zhēng)議的問(wèn)題。近期一項(xiàng)基于12項(xiàng)研究的薈萃分析表明，與沒(méi)有遺傳異常的患者（使用精液精子或睪丸精子）相比，缺失患者除受精率顯著下降外，其他生殖結(jié)果（如胚胎質(zhì)量、臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率）都沒(méi)有變化。

 Y染色體微缺失的傳播對(duì)后代健康的潛在影響是一個(gè)激烈爭(zhēng)論的問(wèn)題。雖然父親的缺失必然會(huì)遺傳給男性后代，從而導(dǎo)致子代精子發(fā)生受損，但由于不同的遺傳背景和不同環(huán)境因素對(duì)生殖功能的影響，確切的睪丸表型無(wú)法預(yù)測(cè)。據(jù)報(bào)道，受Yq微缺失影響的父親經(jīng)ICSI所生嬰兒的數(shù)量仍然相對(duì)較低，只有268例有充分記錄。這些兒童中，除了一名在出生時(shí)患有肺動(dòng)脈閉鎖和右心室發(fā)育不全以及一名患有非特定“嚴(yán)重畸形”外，表型似乎都正常；而這兩名兒童的父親都攜帶AZFc缺失。人們對(duì)后代患特納綜合征（45,X）的潛在風(fēng)險(xiǎn)以及與性染色體嵌合體相關(guān)的其他表型異常（包括生殖器模糊）表示擔(dān)憂(yōu)。關(guān)于患有Y微缺失的男性和具有嵌合46,XY/45,X染色體核型和/或Turner患者數(shù)據(jù)表明，一些Yq微缺失可能與整體Y染色體不穩(wěn)定有關(guān)，這可能導(dǎo)致45,X細(xì)胞系的形成。在268例報(bào)告的Yq缺失父親所生的ICSI嬰兒中，沒(méi)有觀察到生殖器模糊或特納綜合征。

 兩篇論文報(bào)道了對(duì)來(lái)自Y染色體缺失攜帶者的胚胎進(jìn)行植入前遺傳診斷，并提供了胚胎非整倍體率的數(shù)據(jù)。其中一項(xiàng)研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)性染色體異常，而另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了更高比例的X單體胚胎。建議在與患者討論染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)要謹(jǐn)慎。此外，由于攜帶45,X染色體核型的胚胎有很高的自然流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，Yq缺失男性伴侶流產(chǎn)率可能更高。然而，這種可能性還有待正式檢驗(yàn)。

 沒(méi)有證據(jù)表明AZFc完全缺失與后代的智力、心理或運(yùn)動(dòng)發(fā)育障礙有關(guān)。位于假常染色體區(qū)（PAR）的SHOX（矮小同源盒）基因的單倍體充足性的假定關(guān)聯(lián)在更大的多中心研究中沒(méi)有被復(fù)現(xiàn)，也沒(méi)有在智利人群的獨(dú)立研究中發(fā)現(xiàn)。后者僅在等臂染色體Yp和/或Y缺對(duì)相關(guān)的終端AZFbc缺失患者中發(fā)現(xiàn)了PAR異常。這項(xiàng)研究還報(bào)道了7名AZFbc終端缺失和核型異?；颊咧械?名出現(xiàn)神經(jīng)障礙。值得注意的是，這一發(fā)現(xiàn)在更大的隊(duì)列中的驗(yàn)證仍有待確定。

總之，Y染色體微缺失的分子診斷指征是基于嚴(yán)重生精量減少，強(qiáng)烈建議無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精癥患者進(jìn)行檢測(cè)。然而，需要AZF缺失檢測(cè)的嚴(yán)重少精癥的閾值（1×106/mL至5×106/mL精子濃度范圍內(nèi)）仍存在爭(zhēng)議（見(jiàn)上文）。AZF檢測(cè)對(duì)精子提取具有預(yù)后價(jià)值，如果在精液或睪丸活檢中發(fā)現(xiàn)精子，則缺失將傳遞給男性后代。雖然數(shù)據(jù)存在異質(zhì)性，但最新薈萃分析表明，除受精率外，Y染色體重排不會(huì)顯著影響MAR結(jié)果。盡管在過(guò)去10年間，父親Y染色體缺失所生嬰兒的數(shù)量進(jìn)一步增加，但仍然沒(méi)有關(guān)于特納綜合征、生殖器模糊或其他染色體異常的確切風(fēng)險(xiǎn)的明確信息。顯然，有必要針對(duì)Yq缺失的男性及其潛在后代制定強(qiáng)有力的后續(xù)計(jì)劃。AZFc完全缺失和AZFb或AZFa部分缺失時(shí)，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室報(bào)告中要求對(duì)該家族的男性成員進(jìn)行分析。此外，AZFc完全缺失或Yq終端缺失時(shí)，建議進(jìn)行廣泛的核型分析（計(jì)數(shù)100個(gè)中期），以排除與結(jié)構(gòu)異常的Y染色體相關(guān)的46,XY/45,X嵌合體。

 

六、AZF部分缺失

6.1 AZFa區(qū)域基因特異性缺失
盡管一些研究發(fā)現(xiàn)單個(gè)AZF基因缺失的發(fā)生頻率非常高，但這些數(shù)據(jù)與一項(xiàng)包含2000多名患者的大樣本研究結(jié)果大相徑庭。所有已確認(rèn)的AZF基因特異性缺失（具有明確的斷點(diǎn)）均位于AZFa區(qū)，其中5個(gè)特異性缺失部分或完全影響USP9Y基因。基因特異性缺失均不是由NAHR引起的，其特異性導(dǎo)致此類(lèi)事件極為罕見(jiàn)，而且AZFa部分缺失的相關(guān)表型異質(zhì)性很大，從無(wú)精子癥到正常精子癥都可能發(fā)生，提示USP9Y是精子發(fā)生過(guò)程中的精細(xì)調(diào)節(jié)因子，而并不是決定性因子。此外，DDX3Y的功能缺失變異是無(wú)精子癥的病因，該基因也是AZFa區(qū)域的關(guān)鍵生精因子。

6.2 AZFc部分缺失——gr/gr缺失及其臨床意義
AZFc區(qū)域特別容易受到NAHR事件的影響，從而可能導(dǎo)致部分缺失和重復(fù)。其中，gr/gr缺失是被研究得較為廣泛的一種，該缺失可以造成AZFc區(qū)域近一半的基因丟失（具有生殖細(xì)胞獨(dú)有或顯性表達(dá)的基因）。gr/gr缺失的表型高度可變，從無(wú)精癥到正常精子量表現(xiàn)不一，對(duì)生精的影響依然存在爭(zhēng)議。且該缺失表型具有群體依賴(lài)性以及可能是TGCT的誘發(fā)因素，并可能在子代中擴(kuò)展為AZFc區(qū)的完全缺失。因此，gr/gr缺失是精子生成障礙遺傳分析風(fēng)險(xiǎn)因素的一個(gè)特例，其是否作為常規(guī)檢測(cè)尚未達(dá)成共識(shí)，需由診斷實(shí)驗(yàn)室和送檢臨床醫(yī)生自行決定。

6.3 診斷指南
檢測(cè)AZF缺失的首選方法是對(duì)Y染色體的選定區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。已有研究表明，與定位于非編碼區(qū)的有效位點(diǎn)相比，使用基因特異性序列位點(diǎn)（STS）并沒(méi)有提高臨床相關(guān)微缺失的檢測(cè)率。因此，從臨床角度來(lái)看，所選位點(diǎn)是擴(kuò)增匿名區(qū)域還是擴(kuò)增特定的MSY基因基本上并不重要。真正至關(guān)重要的是，所選擇位點(diǎn)能夠顯示出一致的微缺失模式。

6.3.1 AZFa缺失檢測(cè)
AZFa區(qū)域的分子檢測(cè)使用兩個(gè)STS標(biāo)記：sY84和sY86。兩者都位于USP9Y和DDX3Y基因上游。根據(jù)缺失的致病機(jī)制和現(xiàn)有數(shù)據(jù)，sY84和sY86同時(shí)缺失時(shí)，并不是100%的AZFa完全缺失，但其概率是非常高的，有可能（盡管很少）兩個(gè)位點(diǎn)都缺失而不影響AZFa的兩個(gè)基因，或只有USP9Y基因受到影響。因此，AZFa缺失檢測(cè)需要進(jìn)行強(qiáng)制性的擴(kuò)展性缺失分析，包括近端邊界sY82（present）/sY1064（absent）以及遠(yuǎn)端邊界sY1065或sY1182（absent）/sY88（present）。近期數(shù)據(jù)表明，相當(dāng)一部分AZFa完全缺失病例中，近端斷點(diǎn)標(biāo)記sY83（既往版本作為sY1064的等效選項(xiàng)）仍然存在。因此，為了避免將AZFa完全缺失誤診為部分缺失，強(qiáng)烈建議在擴(kuò)展性缺失分析中使用sY1064而不是sY83（或者至少應(yīng)該檢測(cè)sY1064，以證實(shí)在sY83陽(yáng)性病例中確實(shí)是完全缺失）。這兩個(gè)AZFa基因位于AZFa區(qū)域更遠(yuǎn)端，因此檢測(cè)推薦遠(yuǎn)端AZFa位點(diǎn)與TESE預(yù)后非常相關(guān)，且近端斷點(diǎn)的確切位置（sY83存在或不存在）實(shí)際上并不影響對(duì)缺失的臨床解釋。如果只發(fā)現(xiàn)sY84或sY86缺失（排除擴(kuò)增失?。?，則應(yīng)對(duì)AZFa區(qū)域進(jìn)行更詳細(xì)的研究。然而，這一事件目前被認(rèn)為是非常罕見(jiàn)的。

6.3.2 AZFb缺失檢測(cè)
sY127和sY134分別位于AZFb區(qū)域的中端和遠(yuǎn)端。根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)，絕大多數(shù)情況下，兩個(gè)位點(diǎn)缺失即可表明AZFb區(qū)域完全缺失。但為了明確TESE的預(yù)后，需要使用額外位點(diǎn)進(jìn)行強(qiáng)制擴(kuò)展性缺失分析，所選用位點(diǎn)包括：近端邊界的sY105（present）、sY121/sY1224（absent），以及遠(yuǎn)端邊界的sY1192（absent）和sY153（present）。需要注意的是，以前版本認(rèn)為sY143或sY1192是可以等效的，但最近數(shù)據(jù)表明，sY1192（而不是sY143）對(duì)TESE預(yù)后有價(jià)值。此外，近期數(shù)據(jù)還表明，以前版本中推薦的sY1224（相當(dāng)于sY121）在相當(dāng)數(shù)量的AZFb和AZFbc完全缺失患者中仍然存在。盡管這種變異的表型仍有待表征，但強(qiáng)烈鼓勵(lì)使用位點(diǎn)sY121和sY1224（當(dāng)sY121不存在時(shí)）。再次重申之前的建議，即反對(duì)檢測(cè)位點(diǎn)sY114和sY152（仍包含在一些商業(yè)試劑盒中），因?yàn)樗鼈兌ㄎ挥谌旧w上多個(gè)基因組區(qū)域中。特別地，sY152定位于DAZ基因，類(lèi)似于sY255和sY254。在這方面，再次強(qiáng)調(diào)，根據(jù)sY152的假設(shè)缺失定義的所謂“AZFd”區(qū)域并不存在。盡管一些商業(yè)試劑盒仍然包含這個(gè)假定區(qū)域，但強(qiáng)烈建議不要使用此類(lèi)產(chǎn)品。

6.3.3 AZFc缺失檢測(cè)
位點(diǎn)sY254和sY255是DAZ基因的特異性標(biāo)記位點(diǎn)，DAZ基因在Y染色體序列中以四個(gè)拷貝的形式存在，排列在兩個(gè)簇中。當(dāng)sY254和sY255同時(shí)缺失時(shí)，即可診斷AZFc區(qū)完全缺失。基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，這兩個(gè)位點(diǎn)中單一位點(diǎn)的缺失是極不可能的，提示方法學(xué)錯(cuò)誤。強(qiáng)制擴(kuò)展性缺失分析使用異染色質(zhì)位點(diǎn)sY160區(qū)分完全AZFc缺失（b2/b4缺失模式，sY160存在）和終端缺失（sY1160缺失）。終端缺失以及b2/b4缺失可能與嵌合核型（46,XY/45,X）有關(guān)，因此，出于TESE預(yù)后原因，也應(yīng)要求進(jìn)行核型分析。

如果實(shí)驗(yàn)室決定檢測(cè)gr/gr部分AZFc缺失，可以通過(guò)使用兩個(gè)位點(diǎn)來(lái)實(shí)現(xiàn)：sY1291和sY1191；位點(diǎn)sY1291缺失和sY1191存在即可進(jìn)行判斷。值得注意的是，一項(xiàng)多中心研究中檢測(cè)到5%的假缺失率，強(qiáng)調(diào)了優(yōu)化PCR條件和額外驗(yàn)證步驟的重要性。建議對(duì)亞洲患者進(jìn)行Y單倍群分析，以排除不太可能影響精子發(fā)生的Y譜系固定缺失。

6.3.4 檢測(cè)AZFbc缺失
sY127、sY134、sY254和sY255四個(gè)位點(diǎn)全部缺失提示AZFb和AZFc區(qū)域均完全缺失。更特異性的位點(diǎn)sY116可以用于確定AZFbc的缺失模式，如P4/P1遠(yuǎn)端缺失，sY116存在，或P5/P1遠(yuǎn)端缺失時(shí)sY116也缺失，該定義具有臨床預(yù)后價(jià)值。強(qiáng)烈建議AZFbc缺失時(shí)進(jìn)行異染色質(zhì)位點(diǎn)sY160檢測(cè)，以確定是否存在終端缺失。

6.4 PCR反應(yīng)體系的建立：內(nèi)部質(zhì)量控制和推薦位點(diǎn)
臨床診斷中，基因組DNA的PCR擴(kuò)增需要嚴(yán)格遵守良好的實(shí)驗(yàn)室規(guī)范和質(zhì)量控制的基本原則，檢測(cè)時(shí)必須平行檢測(cè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。AZF缺失檢測(cè)時(shí)，應(yīng)同步檢測(cè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照，即一個(gè)精子發(fā)生正常的男性樣本和一個(gè)女性樣本。此外，需加入空白對(duì)照——水樣（只是用水代替模板DNA，包含除模版DNA外所有成分的PCR反應(yīng)）。每一組PCR反應(yīng)都至少采用兩管或更好的多重PCR進(jìn)行。SRY基因是男性性別決定基因，位于Y染色體短臂，作為內(nèi)對(duì)照，SRY基因可以在ZFY基因丟失時(shí)證明Y染色體特征序列的存在（比如：在XX男性中）。AZF診斷中另一個(gè)重要內(nèi)對(duì)照是ZFX/ZFY基因，ZFX/ZFY檢測(cè)不僅與女性對(duì)照DNA相關(guān)，而且與SRY陰性的46,XX男性相關(guān)，是唯一的陽(yáng)性標(biāo)記。
原則上，在每個(gè)AZF區(qū)域中僅分析一個(gè)非多態(tài)性STS位點(diǎn)，就足以確定AZFa、AZFb或AZFc中是否存在缺失。然而，任何一個(gè)已知缺失區(qū)域都包括多個(gè)STS位點(diǎn)，分析每個(gè)區(qū)域中的2個(gè)STS位點(diǎn)可以提高診斷的準(zhǔn)確性。因此，在檢測(cè)的第一步（基礎(chǔ)檢測(cè)分析）中，每個(gè)AZF區(qū)域中至少應(yīng)分析2個(gè)STS位點(diǎn)。基于眾多實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，外部質(zhì)量控制結(jié)果，并考慮到多重PCR擴(kuò)增的形式，以前版本指南中推薦的STS引物的首選仍然有效。這些引物包括：
AZFa：sY84*；sY86
AZFb：sY127；sY134
AZFc：sY254，sY255（均在DAZ基因中）

*更新了sY84-F和sY84-R的序列。根據(jù)最新測(cè)序數(shù)據(jù)，sY84-F引物序列中間位置存在錯(cuò)配，新指南對(duì)引物序列進(jìn)行了修正。關(guān)于sY84-R，在亞洲人群中檢測(cè)到引物序列第5核苷酸位置存在一個(gè)基因多態(tài)性SNP（rs72609647）。因此，如果該來(lái)源的樣本擴(kuò)增失敗，應(yīng)檢測(cè)sY84的替代引物和/或sY84的替代鄰近位點(diǎn)。

對(duì)于強(qiáng)制擴(kuò)展性缺失分析，推薦的引物為：
AZFa：近端斷點(diǎn)：sY82和sY1064；遠(yuǎn)端斷點(diǎn)：sY1065（或sY1182）和sY88
AZFb：近端斷點(diǎn)：sY105和sY121/sY1224；遠(yuǎn)端斷點(diǎn)：sY1192和sY153
AZ1Fc：sY160

總之，這兩種引物組的使用足以用于常規(guī)診斷，能夠檢測(cè)幾乎所有臨床相關(guān)的AZF缺失以及文獻(xiàn)中報(bào)道的95%以上的缺失，同時(shí)為T(mén)ESE提供足夠的預(yù)后價(jià)值。強(qiáng)烈鼓勵(lì)所有實(shí)驗(yàn)室采用這些位點(diǎn)，便于實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制，并將檢測(cè)差異降至最低。

6.5 檢測(cè)結(jié)果及重復(fù)檢測(cè)結(jié)果解釋
指南建議的方案都經(jīng)過(guò)認(rèn)真設(shè)計(jì)和優(yōu)化，采用兩管多重PCR反應(yīng)，每管多重PCR反應(yīng)體系中都包括每個(gè)區(qū)域的一個(gè)位點(diǎn)。因此，當(dāng)樣本中發(fā)生完全缺失時(shí)，兩管PCR反應(yīng)都應(yīng)顯示該區(qū)域特異性位點(diǎn)缺失。雖然如果相關(guān)區(qū)域僅一個(gè)位點(diǎn)缺失，AZFa和AZFb區(qū)域的部分缺失是可能的，但僅sY254或sY255（AZFc/DAZ）的選擇性單個(gè)位點(diǎn)缺失通常被視為方法學(xué)錯(cuò)誤。如果只有一個(gè)AZFa或AZFb位點(diǎn)缺失，則首先必須仔細(xì)求證該缺失情況，然后對(duì)整個(gè)區(qū)域進(jìn)行更詳細(xì)的研究。如果AZFabc缺失（所有8個(gè)Yq位點(diǎn)都缺失），則對(duì)照位點(diǎn)（SRY和ZFX/ZFY）的解釋非常重要，以排除技術(shù)問(wèn)題。
每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)可用的設(shè)備和試劑（如PCR儀和DNA聚合酶的類(lèi)型）以及DNA質(zhì)量/數(shù)量/來(lái)源，仔細(xì)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件。如果結(jié)果不明確和/或懷疑存在技術(shù)故障，則應(yīng)重復(fù)進(jìn)行多重反應(yīng)。如果多重反應(yīng)對(duì)特定的DNA樣本不起作用，則可以在單管反應(yīng)中運(yùn)行引物組。如果兩個(gè)多重PCR的結(jié)果一致支持缺失，則該缺失被確認(rèn)。如果兩個(gè)多重PCR檢測(cè)的結(jié)果不一致，則應(yīng)在單管PCR中重復(fù)整套引物。單管PCR不易發(fā)生擴(kuò)增失敗，強(qiáng)烈建議在較低的退火溫度下重復(fù)反應(yīng)。為避免擴(kuò)增失敗，應(yīng)極力避免相同引物的重復(fù)凍融。關(guān)于反應(yīng)重復(fù)次數(shù)，沒(méi)有一般性建議，應(yīng)直到結(jié)果清晰和可重復(fù)（良好的實(shí)驗(yàn)室建議）。

 

七、遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果報(bào)告

報(bào)告應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)化格式編寫(xiě)，并應(yīng)對(duì)非專(zhuān)業(yè)人員清晰友好。一般來(lái)說(shuō)，報(bào)告必須清楚、簡(jiǎn)明、準(zhǔn)確和易于解釋?zhuān)豢梢越邮苁謱?xiě)的報(bào)告。報(bào)告必須包括以下一般信息：

 送檢患者的醫(yī)生身份
 檢測(cè)和出具報(bào)告實(shí)驗(yàn)室的清晰和完整的身份識(shí)別（包括唯一的實(shí)驗(yàn)室編號(hào)/識(shí)別號(hào)碼）
 標(biāo)題
 送檢和報(bào)告日期
 患者信息：完整姓名、姓氏、出生日期和生理性別
 樣本類(lèi)型（如血液、口腔涂片等）
 非專(zhuān)業(yè)人員可以理解的書(shū)面解釋和結(jié)論
 （至少）兩名獨(dú)立評(píng)估人員的簽名（包括他們的職責(zé)）
 頁(yè)碼
 如果報(bào)告超過(guò)一頁(yè)，頁(yè)碼應(yīng)該清晰（如第X頁(yè)/共Y頁(yè)），每頁(yè)都應(yīng)有患者身份標(biāo)識(shí)

還必須包括以下具體信息：
 以某種形式重述送檢的原因（如，對(duì)Y染色體微缺失的診斷）和適應(yīng)癥（如，無(wú)精子癥、ICSI準(zhǔn)備、pre-TESE等）。
 所用方法（如多重PCR擴(kuò)增），包括檢測(cè)方法的局限性；如果使用了市售的試劑盒，則必須披露其名稱(chēng)、制造商和批號(hào)。
 如果檢測(cè)/分析外包給外部實(shí)驗(yàn)室或公司，必須清楚地說(shuō)明這些信息。
 分析結(jié)果：必須報(bào)告被檢測(cè)位點(diǎn)的結(jié)果。最好利用表格列出所有支持解釋的STS位點(diǎn)結(jié)果（注意：如果使用了包含大量位點(diǎn)的試劑盒，建議在報(bào)告中只列出與解釋相關(guān)的位點(diǎn)結(jié)果）。避免使用+和-，這可能會(huì)造成誤解，用單詞代替（例如，present/absent，或類(lèi)似的）。

7.1 Y微缺失檢測(cè)的替代方法
自1999年第一份指南發(fā)表以來(lái)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種評(píng)估Y染色體缺失的替代方法。此外，還提供了各種商業(yè)試劑盒。然而，這些往往包含不必要的大量位點(diǎn)，并由此混淆分析，最終導(dǎo)致“假性”缺失的診斷結(jié)果，尤其是在DNA質(zhì)量和/或PCR條件不理想的情況下。此外，大多數(shù)試劑盒不能通過(guò)單管PCR對(duì)疑似缺失進(jìn)行驗(yàn)證?；诨蛱禺愋晕稽c(diǎn)的多重PCR方法允許檢測(cè)孤立的基因特異性缺失，但這些缺失的臨床意義極端罕見(jiàn)和不明確，阻礙了其在常規(guī)診斷中的應(yīng)用。此外，這些試劑盒中包含基因特異性位點(diǎn)，需對(duì)結(jié)果進(jìn)行特別仔細(xì)的解釋?zhuān)⒃诳赡艿那闆r下驗(yàn)證可疑的單基因缺失。
已公布的替代方法，部分基于指南，部分則沒(méi)有，主要包括毛細(xì)管電泳、real-time PCR、MLPA、aCGH或下一代測(cè)序（NGS）。real-time PCR的優(yōu)點(diǎn)是相對(duì)快速，不涉及凝膠電泳，但所需的設(shè)備比標(biāo)準(zhǔn)方法更不容易獲得。AZF區(qū)域的特殊結(jié)構(gòu)及其在不同人群中的顯著差異對(duì)廣泛實(shí)施基于NGS的方法提出了重大挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)可能導(dǎo)致診斷錯(cuò)誤，并強(qiáng)烈建議在沒(méi)有適當(dāng)驗(yàn)證和Y染色體分析的廣泛專(zhuān)業(yè)知識(shí)的診斷條件下考慮使用基于NGS的方法時(shí)要謹(jǐn)慎。隨著這項(xiàng)技術(shù)的可用性和正確實(shí)施變得越來(lái)越普遍，它可能會(huì)帶來(lái)新的、更全面的檢測(cè)，從而進(jìn)一步提高無(wú)精子癥男性的診斷率。

總之，在以前版本的指南中建立的兩步多重PCR仍然是進(jìn)行Y染色體缺失檢測(cè)的最具成本效益、可重復(fù)性和最容易獲得的方法。如果實(shí)驗(yàn)室決定建立替代方法，則需要在適當(dāng)數(shù)量的樣本上驗(yàn)證新方法，包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照，以評(píng)估檢測(cè)的特異性和敏感性。無(wú)論何時(shí)采用替代方法，報(bào)告都應(yīng)明確包括所使用的確切實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，而不是將其稱(chēng)為“根據(jù)指南”。后者僅適用于本文所述的兩步多重PCR+強(qiáng)制擴(kuò)展性缺失分析。

 

八、EAA/EMQN外部質(zhì)量評(píng)估22年經(jīng)驗(yàn)

強(qiáng)烈建議進(jìn)行AZF檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室加入年度“EQA計(jì)劃”。該計(jì)劃每年向參與實(shí)驗(yàn)室分發(fā)三份具有模擬臨床病例特征的、經(jīng)驗(yàn)證的DNA樣本，處理方式與患者樣本的處理方法完全相同，包括報(bào)告。實(shí)驗(yàn)室結(jié)果由至少兩名獨(dú)立評(píng)審員進(jìn)行評(píng)估。從2000年至2012年，參與該計(jì)劃的實(shí)驗(yàn)室數(shù)量幾乎增加了兩倍，從57個(gè)增加到148個(gè)（圖3A），這一數(shù)字在過(guò)去10年中一直保持穩(wěn)定。診斷錯(cuò)誤率也急劇下降，從該項(xiàng)目開(kāi)始前5年的近8%下降到目前的1%-2%（圖3B）。參與評(píng)估的診斷報(bào)告質(zhì)量和結(jié)果解釋顯著提高，在過(guò)去4年中，超過(guò)70%的分析報(bào)告獲得滿(mǎn)分。值得注意的是，不必要的大量位點(diǎn)檢測(cè)——通常是商用試劑盒的一部分——仍然是解釋錯(cuò)誤的主要來(lái)源?？傊?，這一既定的EAA/EMQN AZF方案已經(jīng)證明，它是提高參與實(shí)驗(yàn)室績(jī)效的一個(gè)有價(jià)值的工具，建議進(jìn)行AZF檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室都加入該年度計(jì)劃。

圖3 EAA/EMQN外部質(zhì)量控制方案在評(píng)估實(shí)驗(yàn)室績(jī)效方面的22年經(jīng)驗(yàn)結(jié)果

 

 

參考文獻(xiàn)：

[1] Krausz C, Navarro-Costa P, Wilke M, Tüttelmann F. EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions: State of the art 2023. Andrology. 2023;1-18. https://doi.org/10.1111/andr.13514