2021年5月,中信湘雅生殖與遺傳??漆t(yī)院林戈、杜娟團(tuán)隊(duì)在《Mol Genet Genomic Med》期刊上發(fā)表一篇題為“Next-generation sequence-based preimplantation genetic testing for monogenic disease resulting from maternal mosaicism”的文章,該研究通過超深度測序?qū)颊咔逗线M(jìn)行驗(yàn)證,隨后利用NGS-SNP單體型連鎖分析技術(shù)對(duì)相應(yīng)疾病進(jìn)行了PGT-M阻斷,并成功生育健康后代。嘉寶仁和為該研究提供了SNP單體型構(gòu)建、胚胎檢測及數(shù)據(jù)分析服務(wù)。
嵌合體是指一個(gè)個(gè)體或一種組織中,含有源于單個(gè)受精卵但遺傳組成不一致的兩種或以上細(xì)胞系的現(xiàn)象。根據(jù)染色體異常是否累及生殖腺細(xì)胞以及是否可傳遞給子代,嵌合體可分為體細(xì)胞嵌合體、生殖腺嵌合體和體細(xì)胞-生殖腺嵌合體。生殖腺嵌合體雖然不會(huì)產(chǎn)生臨床表型,但可能會(huì)傳遞給后代并導(dǎo)致疾病的發(fā)生,這對(duì)由其導(dǎo)致的單基因病的PGT-M阻斷及其遺傳咨詢提出了很大挑戰(zhàn)。因此,亟需構(gòu)建一個(gè)能夠準(zhǔn)確識(shí)別母體嵌合,并對(duì)由其導(dǎo)致的單基因病進(jìn)行有效阻斷的體系,以降低對(duì)子代健康的影響。
研究方法
根據(jù)招募標(biāo)準(zhǔn),2017年12月到2019年5月,該項(xiàng)目共納入4對(duì)夫婦進(jìn)行研究,納入標(biāo)準(zhǔn)及具體研究流程見圖1。
▲圖1 研究流程
研究結(jié)果
對(duì)納入的4名女性患者的疑似嵌合體致病變異進(jìn)行超深度測序驗(yàn)證分析,證實(shí)該4名女性均存在嵌合變異,嵌合比例分別為1.12%、9.0%、27.60%和91.03%。
▲表1 4名女性患者攜帶嵌合變異信息
(引自文獻(xiàn)1)
案例 1
夫婦二人已育有1名X-連鎖腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良男性患兒。一代測序結(jié)果顯示,患兒ABCD1基因存在c.1859_1860insTA (p. His621Thrfs*16)變異;而女方在該位點(diǎn)變異信號(hào)較低,不能與噪音背景進(jìn)行區(qū)分。
經(jīng)超深度測序驗(yàn)證,女方該位點(diǎn)的確存在嵌合變異,嵌合比例為9.0%。
該夫婦共檢測9枚囊胚,均未發(fā)現(xiàn)致病性變異。其中,胚胎1、3、5、8和9遺傳了母親野生型單體型;而胚胎2、4、6和7遺傳了母親沒有ABCD1基因變異的致病單體型。最終夫婦二人移植胚胎1后成功妊娠,于孕中期經(jīng)羊水穿刺進(jìn)行產(chǎn)前診斷,檢測結(jié)果與PGT-M一致,現(xiàn)已成功誕生一健康男孩。
▲圖2 病例1的家系及囊胚單體型分析
(圖片引自文獻(xiàn)1)
案例 2
夫婦二人曾生育1名X-連鎖范可尼貧血癥患兒(已去世)。女方一代測序顯示FANCB基因存在c.1411delT(p. Ser471Glnfs*4) 雜合變異,變異信號(hào)較低;家系分析顯示,女方父親、阿姨以及妹妹(女方母親去世)均不攜帶該變異,推測該變異為新發(fā)變異。
經(jīng)超深度測序驗(yàn)證,女方在該位點(diǎn)變異為嵌合變異,嵌合比例為27.6%。
夫婦二人共獲得8枚囊胚,活檢后通過NGS進(jìn)行SNP連鎖分析顯示,胚胎2、3和4遺傳了母親野生型單體型,胚胎1和5遺傳了母親無變異的致病單體型,而胚胎6、7和8遺傳了母親具有該變異的致病單體型。夫婦二人最終移植胚胎3,并成功妊娠;于孕中期經(jīng)羊水穿刺進(jìn)行產(chǎn)前診斷,結(jié)果正常,現(xiàn)已成功孕育一健康男孩。
▲圖3 病例2的家系及囊胚單體型分析
(圖片引自文獻(xiàn)1)
案例 3
該夫婦已連續(xù)經(jīng)歷了2次終止妊娠,均因超聲顯示胎兒為骨骼畸形。第2個(gè)流產(chǎn)胎兒基因檢測分析結(jié)果顯示,COL1A2基因存在c.1685G>T(p.Gly562Val) 雜合變異(該基因?yàn)槌晒前l(fā)育不全致病基因,呈常染色體顯性遺傳);而夫妻雙方經(jīng)一代測序檢測,均不存在該變異。
經(jīng)超深度測序顯示,女方在該位點(diǎn)變異為嵌合變異,嵌合比例為1.12%。
共檢測8枚囊胚,其中胚胎2和胚胎5遺傳了母親野生型單體型,胚胎1和胚胎3遺傳了母親無變異的致病單體型,而胚胎4遺傳了母親帶有變異的致病單體型。最終胚胎2被移植,并成功妊娠;經(jīng)產(chǎn)前診斷結(jié)果正常,現(xiàn)已成功誕生一健康女嬰。
▲圖4 病例3的家系及囊胚單體型分析
(圖片引自文獻(xiàn)1)
案例4
該夫婦二人中,女方有神經(jīng)纖維瘤表型,但其父母臨床表型均正常。外周血MLPA結(jié)果顯示,女方攜帶NF1基因缺失雜合子,而其父母均未檢測到該變異;但因女方基因缺失區(qū)域18個(gè)有效SNP位點(diǎn)雜合比例很低,推測為嵌合體。
經(jīng)超深度測序驗(yàn)證,女方存在NF1基因變異的嵌合體,在外周血細(xì)胞中的嵌合比例高達(dá)91.03%,而在口腔黏膜細(xì)胞中只有15.70%。
▲圖5 病例4的家系單體型分析
(圖片引自文獻(xiàn)1)
共活檢3枚囊胚及其相對(duì)應(yīng)的極體(胚胎1的PB2被降解)。極體檢測結(jié)果顯示,胚胎1 的PB1為沒有NF1基因缺失的致病單體型雜合子,胚胎2和胚胎3的PB1為野生型單體型,而對(duì)應(yīng)的PB2遺傳了沒有NF1基因缺失的致病單體型。囊胚檢測結(jié)果顯示,胚胎1遺傳了母體野生型單體型,胚胎2和胚胎3遺傳了致病單體型,但根據(jù)對(duì)PBs的分析,這兩個(gè)胚胎均未攜帶NF1基因缺失,這一結(jié)果通過構(gòu)建STR單體型進(jìn)行了驗(yàn)證。因此,這三枚胚胎均正常并可進(jìn)行移植,最終夫婦二人移植了胚胎1并成功妊娠;孕中期經(jīng)產(chǎn)前診斷結(jié)果正常,現(xiàn)已誕生一名健康男孩。
▲圖6 病例4的胚胎單體型分析
(圖片引自文獻(xiàn)1)
嵌合變異可以通過超深度測序技術(shù)被有效檢出,而由母體嵌合變異導(dǎo)致的單基因病可進(jìn)一步通過基于NGS技術(shù)的SNP單體型連鎖分析進(jìn)行PGT-M精準(zhǔn)阻斷,阻止嵌合變異向子代的傳遞,確保子代的健康。
參考文獻(xiàn)
[1] Hu Xiao, He Wenbin, Zhang Shuoping, et al. Next-generation sequence-based preimplantation genetic testing for monogenic disease resulting from maternal mosaicism[J]. Mol Genet Genomic Med, 2021, 9: e1662.